组织标本经甲醛固定24-48h ，常规脱水 、透明 、浸蜡和包埋 ；4μm石蜡切片 ，贴在涂有APES胶的干净载玻片上 。58℃烤8-24h 。ISH试剂的配制（所有试剂和用具均用DEPC水处理） 。

二
、操作流程
： 

一 、杂交片的前处理

1 、常规脱蜡至水 。

2 、0.01mol/L,pH8.0 EDTA(用0.02 mol/L,pH8.0TB配制)  98℃ 煮 15min;

3 、自然冷却 15min,蒸馏水洗2-5min;

4 、2μg/ml蛋白酶K(用TE配制) 室温 4min, 0.1mol/L甘氨酸PBS洗10min. ；

5 、蒸馏水洗2-5min;

6 、75%,85%,95%,100%酒精系列脱水各1min ；

二 、杂交

将荧光标记探针加入48ul无RNAas PBS溶解 ，用杂交液（4×SSC,25%去离子甲酰胺, 无RNAas PBS）1:200稀释,20ul杂交液并覆盖 ，55℃杂交90min, 37℃杂交 ：24h ，

三 、杂交后洗涤（洗涤过程应避光）

(1)将切片浸入杂交后洗涤缓冲液的洗缸中72℃ 30min（洗缸应提前30min放入72℃水浴锅内预热到72℃ ，2×10min 。

★杂交后洗涤缓冲液 ：2×SSC/0.3% NP-40

20×SSC pH5.3            100ml

蒸馏水                        847ml

NP40                           3ml

最后体积                     1000ml

用1N NaOH调pH7.0-7.5 。

(2)2×SSC.0.3% NP-4073℃洗3min 。

⑶0.4×SSC.0.3% NP-4073℃洗3min

⑷70%乙醇洗 1min

(3)每片滴加10μl  DAP1(4,6 diamidino-2-phenylinodole)封片衬染5min 。

(4)不及时观察 ，可将切片保存在-20℃冰箱暗处 ，观察时复温至室温即可 。